Molekulární genetická metoda vyšetřování

Pro studium a identifikaci variant ve struktuře DNA se používá molekulární genetická metoda. Pro každou oblast DNA, která je zkoumána, je oblast chromozomem, genem nebo alelou, metody jsou různé. V srdci každé molekulární genetické metody obsahuje nějakou manipulaci s RNA a DNA. Všechny tyto metody jsou extrémně složité, bez laboratorních podmínek a pracovníci musí být vysoce kvalifikovaní. Tato práce se provádí v několika etapách.

Etapy

Nejprve je třeba získat vzorky RNA nebo DNA. Zde je molekulárně genetické metoda může být použita prakticky jakéhokoliv materiálu: kapku krve, leukocyty, fibroblasty kultury, sliznice (loupaný), dokonce i vlasové folikuly, - DNA může být získána z jakéhokoli vzorku. Je vhodná pro aplikaci jakýchkoli molekulárně genetických metod a jejich různých variant a již přidělená DNA je dlouhodobě skladována při zmrazení. Druhý stupeň je určen pro hromadění požadovaných fragmentů (amplifikace DNA), protože pomáhá zajistit polymerázové řetězové reakce in vitro (in vitro bez zapojení živý organismus). V důsledku toho se vybraný fragment DNA násobí touto řetězovou reakcí a množství DNA se zvětšuje doslova milionkrát.

Třetí fází molekulárně genetických metod vyšetřování je omezení násobené DNA (to je fragmentace, trhání nebo řezání). Omezení se provádí elektroforézou na bázi polyakrylamidu nebo agarosového gelu. Tato molekulární genetická metoda studia DNA umožňuje, aby každý fragment obsadil určitou pozici v gelu. Poté je gel ošetřen ethidiumbromidem, který je schopen se vázat v DNA, provádí se ultrafialové ozařování, po kterém je možné pozorovat luminiscenční oblasti. Molekulární genetické metody diagnózy jsou různé a početné, nicméně první dvě fáze jsou typické pro všechny. K identifikaci fragmentů DNA však může být gel zbarven mnoha jinými existujícími metodami.

Odrůdy

Mezi přímé a rozšířené metody pro detekci mykobakterií může obsahovat výše uvedené metody molekulární genetickou DNA učení. Jeho podstatou je odhalování specifických fragmentů řetězce DNA patogenů v diagnostickém materiálu. Molekulární genetické metody diagnózy ještě nemají účinnější způsob rozpoznání takové nemoci, jako je tuberkulóza. Pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR), může si být jistý, že původní DNA se zvýší počet kopií v miliónkrát, to znamená, že dojde k zesílení, a zobrazí výsledky. Úroveň citlivosti je zde velmi vysoká - více než devadesát pět procent, což je hlavní výhoda této metody.

Zbytek molekulárně-genetických metod výzkumu o účinnosti výtěžku více kopií doslova zdvojnásobil, protože v tomto případě vypracování vzorek vykazuje specifickou oligonukleotidovou sekvenci zvýší na sto šestkrát. Dokonce i kulturní diagnostika tuberkulózy respiračních orgánů je mnohem nižší v citlivosti. Proto se moderní medicína opírá o molekulární genetické metody diagnostiky tuberkulózy. A popsané metoda je účinná zejména pokud se jedná o vysoce antigenní variability patogenů, identifikovat, které jiným způsobem, je mnohem obtížnější - vyžaduje zvláštní živin a dlouhou dobu kultivace. Biochemické a molekulární genetické metody poskytují zcela odlišné účinky.

Diagnostika tuberkulózy

Marshall PCR diagnostiku tuberkulózy nejčastěji pomocí těchto sekvencí DNA, které jsou specifické pro všechny čtyři typy onemocnění. K dosažení tohoto cíle se často používají primery, které detekují sekvence je prvků (IS-986, IS-6110), neboť tyto prvky charakterizují vysoce stěhovavé druhy Mycobacterium tuberculosis a vždy k dispozici více kopií v genomu. Také extrakce DNA se může provádět z čistých kultur a klinické (sputu) kterýmkoli jiným vhodným způsobem. Například, tam, kde způsob Boom lyzační pufr se používá na základě thiokyanát guanidinu a oxidu křemičitého jako nosiče DNA. Počet pacientů, které se liší špatnou bakteriologických zvyšuje každý rok, a proto se v klinické praxi zavedl zcela odlišnou úroveň organizace: molekulárně-genetická metoda studia DNA hraje významnou roli v diagnostice.

Musíme však přiznat, že to není bez chyb. Použití metody PCR často přináší obrovské množství falešně pozitivních výsledků a chyba zde není pouze technickými chybami, ale také zvláštnostmi samotné metody. Mimo jiné, pomocí této metody diagnózy k určení stupně životaschopnosti mykobakterií, které jsou identifikovány, je prostě nemožné. Tento nedostatek však není ten nejdůležitější. Molekulární genetické metody PCR diagnostiky vyvolávají nebezpečí kontaminace mykobakteriální DNA. Certifikační požadavky z tohoto důvodu pro laboratoře PCR jsou extrémně rigidní, vyžadují přítomnost tří izolovaných místností. Technologie PCR je moderní a velmi složitá, její použití vyžaduje odpovídající vybavení a vysoce vyškolený personál.

Bakterioskopie

Pokud výsledky diagnostiky analýzy musí být ve srovnání s jinými daty: klinické vyšetření, radiografie, stěru mikroskopie, plodiny a dokonce i jako odpověď na specifické léčby jsou velmi důležité. V této sérii studií je PCR pouze jednou ze složek. Detekce patogenu na samém začátku diagnózy může být nejjednodušší a nejrychlejší metoda - bakteriologická.

Zde používáme světelný mikroskop (barvu Tsiol-Nielsen) a luminiscenční (fluorochromované zbarvení). Výhodou bakterioskopie je rychlost, s jakou se výsledky dosáhnou. Nevýhodou je, že jsou omezené možnosti kvůli nízké citlivosti. Tato metoda však doporučuje WHO jako nejhospodárnější a nejdůležitější pro identifikaci pacientů s tuberkulózou. Detekce mykobakterií bakteriologickou metodou má hodnotu prognózy a kvantifikuje se uvolňování bakterií. Molekulární genetické metody studia tuberkulózy jsou s tím mnohem jistější.

Kulturní výzkum

Nejlepší detekce mykobakterií je uznávána studiemi o kultuře. Výsev patologické materiálu je vyrobena do vaječné média: Mordovsky, Finn II, LJ, a podobně. Srovnávací testy rezistence mykobakterií na léky a nepřímé důkazy o účinnosti řady mykobakterií a jejich kolonie in vitro, pokud použité metody výzkumu kultury. Pro zvýšení procenta přidělení mykobakterií se patologický materiál osije na několik médií.

Splnění četných kulturních potřeb, příčinný činitel je také poskytován tekutými médii. Současně se používají automatizované systémy účtování růstu typu VANTES. Plodiny by měly být inkubovány až sedm až osm týdnů. Během této doby lze setí s nedostatkem růstu považovat za negativní. Nejúčinnějším způsobem identifikace tuberkulózy mykobakterií je biologické testy: infikovat diagnostický materiál morčat, které jsou extrémně citlivé na tuberkulózu.

Několik čísel

Nejzajímavější oblastí výzkumu, která byla objevena pomocí diagnostiky PCR, byla studie M. tuberculosis, latentní infekce. Moderní pojetí nákazy TBC naznačuje, že ze sta lidí, kteří byli v kontaktu s M. tuberculosis, devadesát může dobře být infikován, ale pouze deset z nich jsou aktivní onemocnění je vyvíjen. Zbytek má antituberkulovou imunitu, a proto v 90% případů zůstane infekce latentní. Jedná se o molekulární genetickou metodu, která pomáhá detekovat tento vzorec.

Genetici říkají, že padesát pět procent z těch, jejichž plodiny patologický materiál byly negativní, a osmdesát procent lidí infikovaných M. tuberculosis, ale proudí bez radiografické projevy onemocnění, PCR pozitivní reakce obdržel. Je to genetická diagnostická metoda pomohla k identifikaci pacientů s rizikem PCR studiích s výsledky jejich analýz (mikroskopie a kultura) byly negativní, a subklinická infekce M. tuberculosis byl přítomen.

Moderní výzkum

Bakteriologické laboratoře Ruské federace používají akcelerovanou metodu absolutních koncentrací: aktivita dusičnan reduktázy mykobakterií se testuje pomocí Grissova činidla. Střediska proti tuberkulóze používají metodu, která umožňuje stanovit rezistenci vůči lékům. Toto je kultura v kapalném médiu, kde je automatizovaný radiometrický a fluorescenční systém pro záznam růstu mykobakterií. Taková analýza se provádí rychle - až dva týdny.

V současné době, nové metody jsou vyvíjeny: rezistence mykobakterií se měří na úrovni genotypu. Studium molekulárních mechanismů rezistence ukazuje přítomnost genů v mykobakteriích. Tyto geny jsou spojeny s odolností vůči určitým lékům. Například geny Kasa, inhA, katG odolný vůči isoniazidu, rpoB genu - rifampicin RNA genů 16SP a rpsL - streptomycin, emb1 - na ethambutolu, gyrA - fluorochinolon, a tak dále.

Mutace

V moderní diagnostice se výrazně zvýšila molekulární genetická úroveň metody DNA a umožnilo provádět rozsáhlé studie mutací v celém spektru. Nyní víme, že mutace v 516, 526 a 531 kodonech genu rpoB jsou nejčastější a byla zjištěna rezistence na různé léky. Existuje celá škála metod pro psaní mykobakterií nejen s použitím tradičních metod - biochemických, biologických a kulturních, ale také jsou široce využívány moderní molekulární genetické metody. Již existují adekvátní a spolehlivé diagnostické metody pro detekci monogenních onemocnění. Jsou založeny na výzkumu DNA v přesné oblasti určitého genu. To je obvykle složitý proces, časově náročný a drahý, ale údaje poskytované metodami molekulární genetické analýzy jsou mnohem přesnější a informativnější než data všech ostatních analýz.

Je již dlouho známo, že DNA se nemění po celou dobu životnosti organismu, že je v každém jaderných buněk odnakova, a to umožňuje, aby se na analýzu naprosto všech buňkách těla, v jakékoli fázi ontogeneze. Poškozený gen může být detekována před objevením se prvních příznaků do klinického onemocnění full-scale, stejně jako u zdravých heterozygotní lidí, ale mají mutaci v genu. Molekulárně genetické dědičné onemocnění diagnostické metody umožňují odhalit jeho (přímý přístup, DNA diagnostiku), jakož i pro analýzu segregaci onemocnění v rodině s markerem loci DNA (genetických polymorfismů), které jsou úzce spojeny s poškozeným genem (tj nepřímý přístup DNA diagnostika). Přímá nebo nepřímá - každá diagnóza DNA je založena na metodách, které identifikují striktně definovanou oblast lidské DNA.

Přímé metody

Přímé metody diagnostiky DNA se používají v případech, kdy je známo gen-viník dědičné choroby a jsou známy i jeho mutace. Přímé metody jsou například vhodné pro různé nemoci. To je Huntingtonova chorea (Rozšíření CTG-repetice), fenylketonurie (R408W), cystická fibróza (delF508, hlavní mutace) a podobně. Hlavní výhodou přímých metod je sto procent přesnosti diagnostiky a není třeba provádět analýzu DNA zbytku rodiny. Pokud je nalezena mutace v odpovídajícího genu, umožňuje přesně schválit diagnózu dědičnosti, stanovení genotypu pro zbytek zatíženého rodiny.

Další výhodou přímé diagnózy je detekce heterozygotního transportu špatných mutací u příbuzných a rodičů zemřelých z této nemoci. To platí zejména pro nemoci autosomálně recesivní. Nevýhody přímých metod jsou také k dispozici. Abyste je mohli aplikovat, musíte přesně vědět lokalizaci patologického genu, strukturu exon-intronu a spektru jeho mutací. Ne všechny monogenní nemoci dostaly takové informace dnes. Informativnost přímých metod nemůže být považována za úplnou, protože stejný gen může mít velký počet patologických mutací, které určují vývoj dědičných onemocnění.

Nepřímé metody

Nepřímé metody v diagnostice DNA jsou použity vůbec, v ostatních případech, je-li k poškození genů, které nejsou uvedeny, ale pouze chromosomálně, nebo v případě, že diagnóza linie nedal výsledek (to stane, je-li gen komplexu molekulární organizace nebo velkého rozsahu, pokud existuje mnoho patologické mutace). Nepřímé metody se používají k analýze segregace polymorfních markerů v rodině alel. Markery nalezené ve stejné chromosomální oblasti nebo místo, úzce souvisí s nemocí a představují delece nebo inzerce, bod substituce, opakování, a jejich polymorfismus je kvůli odlišné množství buněk v bloku.

Nejvhodnější pro nepřímé diagnózu považována mikrosatelitů a minisatellite polymorfismů, které jsou široce distribuovány v lidském genomu. Jejich hodnota je vyjádřena vysokou informatičností, pokud genetická vzdálenost mezi poškozením v genu a markerem není příliš velká. V posledně uvedeném případě se přesnost odhadu je určena do značné míry frekvence rekombinace mezi polymorfním markerem a poškození. Nepřímé diagnostické metody také povinné předběžný krok allele frekvencemi analyzovaného populační studie u pacientů a nosičů mutací, plus nutnost určení pravděpodobnosti rekombinace nerovnovážné a adhezních markerů a mutantních alel.

Jiné metody

Krátké úseky RNA nebo DNA, stejně jako jediný gen vizualizované pod mikroskopickou studii nemůže být proto k identifikaci mutací potřebné molekulárně genetická diagnostika. Tam je „Human Genome Project“, jakož i další pokroky v molekulární genetice velmi rozšířil možnosti diagnostiky dědičných chorob - a to jak před a postnatální. Tyto metody mohou poskytnout včasnou detekci a předpovídat poly- a monogenní onemocnění, u kterých se objevuje debut v dospělosti. Bohužel, pokud jde o technické schopnosti, molekulární genetické studie někdy překračují etické rámce, které jsou zavedeny s ohledem na dědičnost, zvláště když je diagnóza prováděna v dospívání a dětství.

Strukturní a kvantitativní anomálie chromozomů jsou nejčastější příčinou onkologických onemocnění a mnoha vývojových anomálií. Je třeba identifikovat chromozomové aberace, což je důležité pro rodinné poradenství - zhodnotit prognózu spolu s reprodukčními riziky v budoucích těhotenstvích. Chromosomová analýza je "zlatým standardem" genetické diagnostiky, ale má také omezené možnosti. Pouze metody molekulární genetické analýzy mohou dělat více, protože používají fluorescenční štítky založené na klonovacích technologiích, jsou schopny detekovat s vysokou citlivostí jemné chromozomální změny, které nemohou být detekovány klasickými cytogenetický výzkum. Tyto techniky stále více rozšiřují naše diagnostické schopnosti, když jsou vyšetřovány děti s vývojovými vadami, s mentální retardací a mnoha dalšími dědičnými nemocemi.

Závěry

To je pro lidstvo velmi důležité byly genové struktury a funkce poznání, typy variability, schopnost detekovat dědičné onemocnění, k nimž došlo v souvislosti s rozvojem molekulární genetiky. Jeho metody jsou zaměřeny na studium molekuly DNA - a když je normální a je poškozena. Příprava sekvencí deoxyribonukleové kyseliny nukleotidů (DNA) se rozprostírá ve stupních od obdržení vzorků pro identifikaci jednotlivých fragmentů. Izolace genomové DNA z buněk, omezení (přetržení), zesílení (klonování), elektroforéza fragmentů (oddělující jejich elektrický náboj a molekulovou hmotnost v agarózovém gelu). Identifikace určitých fragmentů umístěných na jeho povrchu odděleným páskem.

Pak se dostat do zákona speciálních filtrů, přes které prochází každou hybridizaci fragmentů s klonovaných fragmentů DNA nebo syntetické radioaktivních sond je ovládací prvek, který se bude rovnat každého testovaného vzorku. Pokud se změnit polohu nebo délku ve srovnání se sondou, pokud je nový fragment nebo zmizel - to vše naznačuje, že analyzovaný gen prošla restrukturalizaci v nukleotidové sekvenci. Existuje osm základních technik molekulární genetické studie: sekvenování (stanovení sekvence DNA), polymerázová řetězová reakce (zvýšení počtu sekvencí), příprava primerů známých genů, klonování DNA, produkci rekombinantních molekul odvozených proteinů kvůli rekombinantních molekul, vytvoření kompletní sadu (sbírka knihovna) klonovaných fragmentů, které byly získány restrikcí.