Molekulární diagnostika: PCR v reálném čase

V současné době byl vyvinut mechanismus molekulární diagnostiky polymerázová řetězová reakce (PCR), což bylo impulsem pro rozvoj velkého počtu metody diagnostiky nemoci založené na definici genetického materiálu. Pro provedení PCR v reálném čase se fragment genu (zejména nukleová kyselina) způsobující onemocnění, které se u jiných jedinců nevyskytuje.

Principem PCR je násobení určitého DNA fragmentu patogenu milionykrát pomocí DNA polymerázy ve speciálním zařízení nazývaném termocyklus, který poskytuje cyklické opakování teplotního režimu podle daného programu.

Diagnostika PCR umožňuje opakovat řadu amplifikací, čímž se zachová aktivita enzymu. Když zesílení prochází neomezeně, v jednom cyklu počet kopií určité oblasti patogenní DNA zdvojnásobí po třiceti cyklech - sto desetkrát. Proto se v diagnostice používá PCR k identifikaci dostatečně malých patogenů, jejichž detekce je bez této skutečnosti nemožná.

Je třeba poznamenat, že RNA nemůže být maticí pro PCR v reálném čase. Proto, aby byla detekována virové RNA, je nezbytné před amplifikací získat DNA, odpovídající jejímu fragmentu. Polymerázová řetězová reakce umožňuje měřit DNA a RNA patogenu. Takto získané informace se používají k monitorování účinnosti použité terapie a k vyhodnocení klinické prognózy.

Navíc PCR v reálném čase nepotřebuje další kroky k dešifrování studované DNA nebo ampliconů, které slouží jako překážka správné diagnózy a vedou k falešným výsledkům. Tento přístup nám dovoluje nepoužít stupeň elektroforézy, který vede ke snížení rizika infekce produkty polymerázové řetězové reakce. Také v souvislosti se snížením počtu manipulací s patogenem se čas studie sníží, jeho proces je zjednodušen a pravděpodobnost chyb je snížena. PCR také umožňuje stanovit počáteční počet kopií DNA patogenu v klinickém testu, který pomáhá identifikovat období exacerbace nemocí a přijmout včas opatření k vyléčení pacienta.

K dnešnímu dni existuje mnoho metod upevnění zesílení v reálném čase. Nejčastěji se používají různé techniky, které využívají radiochemické korelované sondy, jejichž intenzita záření se mění s akumulací ampliconů, a je zaznamenávána v reálném čase pomocí speciálního zařízení nazývaného zesilovač s optickým modulem. To poskytuje vysokou citlivost analýzy. V tomto případě může být PCR produkt detekován společně s obrovským množstvím vedlejších produktů, zatímco při použití elektroforézy se často nezaznamenává.

Pomocí PCR se v reálném čase používají pozitivní, kontrolní a negativní vzorky. Pozitivní a negativní vzorky jsou tedy během studie analyzovány jako oddělené vzorky, kontrolní vzorek je pak přidán do každého takového vzorku a prochází všemi stupni analýzy.

K dnešnímu dni je k dispozici velký počet nástrojů polymerázové řetězové reakce. Tito zahrnují Bio-Rad, Applied Biosystems, Cepheid nebo Roche. Každá z nich má zásluhy a nedokonalosti

Je třeba poznamenat, že PCR je diagnostickou metodou používanou ve velkých vědeckých, výzkumných a diagnostických centrech po celém světě, protože umožňuje provádět okamžitou interpretaci získaných výsledků.