Imobilizované enzymy a jejich použití

Poprvé pojem imobilizovaných enzymů vznikl ve druhé polovině 20. století. Mezitím již v roce 1916 bylo zjištěno, že sacharóza sorbovaná na uhlíku si zachovala svou katalytickou aktivitu. V roce 1953, D. N. Shleyt Grubhofer provádí první vazební pepsin, amylázu, karboxypeptidasový a RNázy na nerozpustném nosiči. Koncept imobilizovaných enzymů byl legalizován v roce 1971. Toto se stalo na první konferenci o inženýrské enzymologii. V současné době koncept imobilizovaných enzymů

Obecné informace

Aimobilizované enzymy - sloučeniny, které jsou uměle vázány na nerozpustný nosič. Současně si zachovávají své katalytické vlastnosti. V současnosti je tento proces zvažován ve dvou aspektech - v rámci částečného a úplného omezení svobody pohybu proteinových molekul.

Výhody

Vědci si uvědomili jistotu výhody imobilizovaných enzymů. Jako heterogenní katalyzátory se mohou snadno oddělit od reakčního média. V rámci výzkumu bylo zjištěno, že aplikace imobilizovaných enzymů může být více. Během procesu vazby mění sloučeniny své vlastnosti. Získávají substrátovou specifičnost, stabilitu. Současně jejich činnost začíná záviset na podmínkách prostředí. Imobilizované enzymy se vyznačují trvanlivostí a vysokou stabilitou. Je to víc než například volné enzymy v tisících, desítky tisíckrát. To vše zajišťuje vysokou účinnost, konkurenceschopnost a hospodárnost technologií, ve kterých jsou přítomny imobilizované enzymy.

Média

J. Poratu definoval klíčové vlastnosti ideálních materiálů, které by měly být použity pro imobilizaci. Média musí mít:

1. Nerozpustnost.
2. Vysoká biologická a chemická odolnost.
3. Schopnost rychle aktivovat. Nosiče by se měly snadno převést na reaktivní druhy.
4. Významná hydrofilita.
5. Nutná propustnost. Jeho index by měl být stejně přijatelný pro enzymy a pro koenzymy, reakční produkty a substráty.

V současné době neexistuje žádný materiál, který by plně splňoval tyto požadavky. Nicméně v praxi se používají nosiče, které jsou vhodné pro imobilizaci určité kategorie enzymů za specifických podmínek.

Klasifikace

V závislosti na jejich povaze jsou materiály, ve kterých jsou sloučeniny převedeny imobilizované enzymy, jsou rozděleny na anorganické a organické. Vazba mnoha sloučenin se provádí s polymerními nosiči. Tyto organické materiály jsou rozděleny do dvou tříd: syntetické a přírodní. V každém z nich se podle jejich struktury rozlišují skupiny. Anorganické nosiče se skládají hlavně ze skla, keramiky, jílů, silikagelu, grafitu černé. Při práci s materiály jsou metody suché chemie populární. Imobilizované enzymy se získají potahováním nosičů filmem oxidy titanu, hliníku, zirkonu, hafnia nebo zpracování organickými polymery. Důležitou výhodou materiálů je snadná regenerace.

Nosiče bílkovin

Nejoblíbenější jsou lipidové, polysacharidové a proteinové materiály. Mezi posledně uvedenými je třeba zdůraznit strukturní polymery. Především zahrnují kolagen, fibrin, keratin, stejně jako želatinu. Tyto proteiny jsou široce distribuovány v přírodním prostředí. Jsou cenově dostupné a ekonomické. Kromě toho mají pro vazbu velké množství funkčních skupin. Bielkoviny se liší ve své schopnosti biodegradovat. To umožňuje rozšíření aplikace imobilizovaných enzymů v medicíně. Mezitím existují také negativní vlastnosti bílkovin. Nevýhody použití imobilizovaných enzymů na nosičích proteinů je jejich vysoká imunogenicita, stejně jako možnost zavádění do reakce pouze určitých skupin z nich.

Polysacharidy, aminosacharidy

Z těchto materiálů se nejčastěji používá chitin, dextran, celulóza, agaróza a jejich deriváty. Aby byly polysacharidy odolnější vůči reakcím, jejich lineární řetězce jsou zesíťovány epichlorhydrinem. Různé ionogenní skupiny jsou volně zaváděny do síťových struktur. Chitin se hromadí ve velkém množství ve formě odpadu při průmyslovém zpracování krevet a krabů. Tato látka je chemicky odolná a má dobře definovanou porézní strukturu.

Syntetické polymery

Tato skupina materiálů je velmi různorodá a přístupná. Zahrnuje polymery na bázi kyseliny akrylové, styrenu, polyvinylalkohol, polyuretanové a polyamidové polymery. Většina z nich se liší mechanickou pevností. V procesu transformace poskytují možnost měnit velikost pórů v dostatečně širokém rozmezí, zavedení různých funkčních skupin.

Způsoby vazby

V současné době existují dvě zásadně odlišné verze imobilizace. První je příprava sloučenin bez kovalentních vazeb s nosičem. Tato metoda je fyzická. Další možností je vytvoření kovalentní vazby s materiálem. Jedná se o chemickou metodu.

Adsorpce

S ní imobilizované enzymy jsou získány udržováním přípravku na povrchu nosiče v důsledku disperze, hydrofobních, elektrostatických interakcí a vodíkových vazeb. Adsorpce byla prvním způsobem, jak omezit pohyblivost prvků. Tato možnost však ani nyní neztratila význam. Adsorpce je navíc považována za nejobvyklejší způsob znehybnění v průmyslu.

Vlastnosti metody

Ve vědeckých publikacích je popsáno více než 70 enzymů, získaných adsorpční metodou. Nosníky jsou převážně porézní sklo, různé jíly, polysacharidy, oxidy hliníku, syntetické polymery, titan a další kovy. Nejčastěji se používají. Účinnost adsorpce léčiva na nosiči je určena porézností materiálu a specifickým povrchem.

Mechanismus účinku

Adsorpce enzymů na nerozpustných látkách je jednoduchá. Dosahuje se tím, že se vodný roztok léčiva uvede do styku s nosičem. Může se uskutečnit staticky nebo dynamicky. Enzymový roztok se smísí s čerstvou sraženinou, například s hydroxidem titaničitým. Pak se za mírných podmínek suší. Enzymová aktivita s touto imobilizací je téměř 100%. Zároveň specifická koncentrace dosahuje 64 mg na gram nosiče.

Negativní momenty

Nevýhody adsorpce zahrnují nízkou pevnost při vazbě enzymu a nosiče. V procesu změn reakčních podmínek, ztráty prvků, kontaminace produktů, desorpce proteinu lze poznamenat. Pro zlepšení vazebné síly jsou nosiče dříve upraveny. Zejména se materiály ošetřují kovovými ionty, polymery, hydrofobními sloučeninami a dalšími polyfunkčními činidly. V některých případech je modifikace podrobena samotnému léku. Často to ale vede k poklesu jeho aktivity.

Zahrnutí do gelu

Tato volba je poměrně běžná kvůli své jedinečnosti a jednoduchosti. Tato metoda je vhodná nejen pro jednotlivé prvky, ale i pro multienzymatické komplexy. Zahrnutí do gelu může být provedeno dvěma způsoby. V prvním případě se tento přípravek kombinuje s vodným roztokem monomeru, po kterém následuje polymerace. Výsledkem je prostorová struktura gelu, která obsahuje molekuly enzymu v buňkách. Ve druhém případě je přípravek přidán do roztoku konečného polymeru. Potom se přenese do gelového stavu.

Vložení do poloprůhledných struktur

Podstatou této metody imobilizace je oddělení vodného enzymového roztoku od substrátu. Za tím účelem se používá semipermeabilní membrána. Prochází nízkomolekulárními prvky kofaktorů a substrátů a zpomaluje velké molekuly enzymů.

Mikroenkapsulace

Existuje několik možností pro zavedení do poloprůhledných struktur. Velmi zajímavý je mikroenkapsulace a začlenění proteinů do liposomů. První variantu navrhla T. Chang v roce 1964. Spočívá v tom, že enzymatický roztok se zavádí do uzavřené kapsle, jejíž stěny jsou vyrobeny z polopropustného polymeru. Vzhled membrány na povrchu je způsoben reakcí mezifázové polykondenzace sloučenin. Jeden z nich je rozpuštěn v organickém a druhý ve vodní fázi. Jako příklad je možno uvést tvorbu mikrokapslí, získaných polykondenzací halogenidem kyseliny sebakové k-vy (organická fáze) a 1,6-hexamethylendiaminu (v tomto pořadí, se vodná fáze). Tloušťka membrány se vypočítává ve stotinách mikrometru. V tomto případě je velikost kapslí stovky nebo desítky mikrometrů.

Začlenění do liposomů

Tato metoda imobilizace je blízká mikroenkapsulaci. Liposomy jsou reprezentovány v lamelárních nebo sférických systémech lipidových dvojvrstev. Tato metoda byla poprvé použita v roce 1970. Odpaření organického rozpouštědla se provádí za účelem izolace liposomů z lipidového roztoku. Zbývající tenký film je dispergován ve vodném roztoku, ve kterém je enzym přítomen. Během tohoto procesu dochází k samostavbě lipidových dvouvrstvých struktur. Docela populární jsou takové imobilizovaných enzymů v medicíně. To je způsobeno skutečností, že většina molekul je lokalizována v lipidové matrici biologických membrán. Zahrnuty do liposomů imobilizovaných enzymů v medicíně jsou nejdůležitějšími výzkumnými materiály, které umožňují studovat a popsat zákony životního procesu.

Vytvoření nových odkazů

Imobilizace za vzniku nových kovalentních řetězců mezi enzymy a nosiči se považuje za nejhmotnější metodu pro získání průmyslových biokatalyzátorů. Na rozdíl od fyzikálních metod poskytuje tato možnost nevratnou a pevnou vazbu mezi molekulou a materiálem. Její vzdělávání je často doprovázeno stabilizací drogy. Současně umístění enzymu ve vzdálenosti první kovalentní vazby vzhledem k nosiči vytváří určité potíže při provádění katalytického procesu. Molekula se oddělí od materiálu pomocí vložky. Polyfunkční a bifunkční činitelé často působí jako oni. Jsou zejména jsou hydrazin, bromkyan, glutaraldehyd dialgedrid, sulfurylchlorid a tak dále. Například, pro odvození galaktosyltransferáza enzymu z média a následující sekvence vložena -CH₂-NH- (CH₂).₅-CO-. V takové situaci je ve struktuře vložka, molekula a nosič. Všechny jsou spojeny kovalentními vazbami. Zásadní význam, je potřeba zavést funkční skupiny při reakci, není nezbytný pro katalytické funkce prvku. Takže, obvykle, glykoproteiny jsou připojeny na nosný protein není u konce, a prostřednictvím sacharidového zbytku. V důsledku toho je stabilnější a aktivnější imobilizované enzymy.

Buňky

Výše popsané metody jsou pro všechny typy biokatalyzátorů považovány za univerzální. Mezi nimi mimo jiné patří buňky, subcelulární struktury, jejichž imobilizace se nedávno rozšířila. Důvodem je následující. Při imobilizaci buněk není nutné izolovat a purifikovat enzymové přípravky, aby do reakce byly zavedeny kofaktory. Výsledkem je získání systémů, které provádějí vícestupňové, nepřetržité procesy.

Použití imobilizovaných enzymů

Ve veterinární medicíně, průmysl, ostatní hospodářská odvětví jsou poměrně populární přípravky získané výše uvedenými metodami. Rozvinuté přístupy poskytují řešení problémů při zavádění cíleného poskytování drog v těle. Imobilizované enzymy umožnily získat dlouhodobě působící léky s minimální alergenitou a toxicitou. V současné době vědci řeší problémy spojené s biokonverzí hmoty a energie pomocí mikrobiologických přístupů. Technologie imobilizovaných enzymů přitom významně přispívá k práci. Perspektivy vývoje jsou pro vědce dostatečně široké. Takže v budoucnu jedním z klíčových rolí v procesu kontroly nad životního prostředí by mělo patřit do nové typy analýz. Zejména mluvíme o bioluminiscenčním a imunoenzymatické metody. Zvláštní význam mají pokročilé přístupy při zpracování lignocelulózových surovin. Imobilizované enzymy lze použít jako zesilovače slabých signálů. Aktivní místo může být pod vlivem média, které je pod působením ultrazvuku, mechanickému namáhání nebo vystavené fytochemikálie transformací.