Izoelektrický bod proteinu a jeho definice. Co určuje izoelektrický bod bílkovin? Proč je izoelektrický bod odlišný pro různé bílkoviny?

Proteinové molekuly jsou amfoterní báze, protože obsahují volné aminoskupiny a karboxyskupiny. Pokud je pH roztoku menší než 7, má negativní náboj a při pH větší než 7 - pozitivní náboj. Když jsou tyto náboje rovné, což je dosažitelné, když je v roztoku zjištěna určitá kyselost nebo zásaditost, je stanoven takzvaný izoelektrický bod proteinu.

Koncept izoelektrického bodu

Proteiny jsou složeny z aminokyselin. Některé z těchto sloučenin (arginin, kyselina asparagová, histidin, kyselina glutamová, lysin) jsou reprezentovány jako radikály obsahující ionogenní skupiny, tj. Skupiny schopné ionizace. Kromě nich jsou alfa-karboxylové a aminoskupiny umístěné na uhlíkových a dusíkových koncích polypeptidových řetězců schopné ionizace. Je-li pH roztoku 7 nebo blízké této značce, pak jsou v ionizovaném stavu všechny ionogenní skupiny. Protože se hodnota pH z této hodnoty odstraní v jednom nebo druhém směru a převážně na kyselé, začne protein přecházet do izoelektrického stavu, ve kterém se molekula této látky stává elektricky neutrální, počet ionizovaných skupin má tendenci k nule. Hodnota pH, při níž jsou proteiny převedeny na izoelektrický stav, se nazývá izoelektrický bod proteinů (IET).

Fyzikálně chemická povaha proteinů

Vzhledem k tomu, že složení proteinů obsahuje karboxy- a aminové skupiny, mohou disociovat jak báze, tak kyseliny. Volná karboxylová skupina dává kladně nabitý iont vodíku a COO-anion při disociaci. Výsledkem je, že vodíkový iont je připojen k aminoskupině, která charakterizuje základní vlastnosti proteinu, což vede k tvorbě proteinových částic s negativními a pozitivními náboji. Když je protein umístěn v kyselém roztoku, jeho disociace s kyselinami bude potlačena kvůli významné přítomnosti kationtů vodíku. Naopak, pokud je umístěno do hlavního řešení, jeho hlavní disociace bude potlačena kvůli přítomnosti COO-aniontů.

Přenášení elektrického proudu roztokem bílkovin způsobí, že se anionty budou pohybovat směrem k katodě a kationty k anodě. V jakémkoli proteinu existuje určitá hodnota pH, při které nedojde k pohybu iontů při procházení proudu. V tomto případě hovoříme o rovnosti různých iontů a rovnosti různých stupňů (základní a kyselé) v proteinové molekule, která je charakterizována izoelektrickým stavem.

Jak je známo, voda je dipól, takže má své částice okolo proteinové molekuly, v závislosti na tom, jak je nabitá. V izoelektrickém bodě molekula proteinu nemá hydratovanou orientovanou skořápku. Pokud se provádí srážení bílkovin, je nutné nejprve zničit hydratovanou skořápku odstraněním elektrického náboje.

Využití IET v průmyslu

V izoelektrického, některé vlastnosti proteinového roztoku, jako je například otok, viskozita, osmotický tlak, propustnost světla, mají minimální hodnotu, přičemž se dosáhne index lomu a optická hustota, na rozdíl od, maximální hodnoty. Protein isoelektrický bod může být určena empiricky stanovením závislost proteinového roztoku výše uvedených vlastností: pH, pozici extrémy v grafech pí určena. V isoelektrický stavu může srážet kasein, který se používá při výrobě sýrů a mléčných výrobků, kaseinu z odstředěného mléka jako suroviny v různých průmyslových odvětvích (kasein lepidla, umělé potravy a t. D.). Měření pí posoudit kvalitu proteinu, zejména mléčného výrobku na přítomnost nečistot. To platí i dnes, protože zavedení bylinných doplňků v mléčném základu může nahradit část živočišných bílkovin se zeleninou, která je levnější.

Kromě toho může být izoelektrický bod proteinu použit při čištění odpadních vod z drůbežárny. Hlavní podíl kontaminace odpadních vod na jatkách drůbeží farmy je tudíž zapotřebí krevních bílkovin. Vzhledem k tomu, že IET většiny proteinů je v zóně slabě kyselé reakce média, nastane úplná extrakce proteinů při slabě kyselé reakci média při pH, který má tendenci k IET.

Faktory ovlivňující IET

Na pí je ovlivněn několika faktory. Uvažujme, co určuje izoelektrický bod proteinu. Za prvé, je dána převahou aminových nebo karboxylových skupin, jako část molekuly proteinu. Většina proteinů jsou silnější kyseliny ve srovnání s bází, aby se pí nižší než 7. K dispozici je skupina proteinů, které jsou silnější báze než kyselin jejich pí vyšší než 7. silná korelace mezi izoelektrického bodu proteinu a obsahu iontů roztok soli. Koncentrace proteinu nemá žádný vliv na účinnou složku. Výše uvedené faktory vysvětlují, proč je izoelektrický bod je pro různé proteiny.

Příklady IET proteinů:

• pepsin má hodnotu IET asi 1;
• kasein a želatina - 4,7;
• vaječný albumin - 4,8;
• mucin - 2,7;
• pepsinogen - 3,7;
• albumin - 4,6;
• inzulín - 5,3;
• oxyhemoglobin - 6,8;
• karboxyhemoglobin - asi 6,9;
• myoglobin - 7,0;
• chymotrypsin - 8,6;
• cytochrom C - 10,5;
• salmin - 12.

IET a jeho definice

Všechny metody pro stanovení izoelektrického bodu proteinů jsou založeny na přípravě tlumivých roztoků s různým reakčním médiem. Ve všech těchto řešeních jsou umístěny stejné hmotnosti studovaného proteinu, které mohou být buď suché, nebo v suchém stavu forma roztoku. Používají se různé metody pro určení IET. Jak zjistit protein izoelektrický bod?

Hlavní metody pro stanovení IET jsou elektroforéza s minimální viskozitou a spojená s použitím dehydratačních látek. Mohou být použity také některé další metody, jako je stanovení rychlosti bobtnání suché bílkoviny, rychlost spekulace, ale jsou méně přesné a vyžadují velké množství bílkovin.

Elektroforéza

Při použití této metody se do zařízení zavádí pásy chromatografického nebo filtračního papíru navlhčené určitým roztokem pufru. Ve středu každého pásu je vytvořena značka tužky, do které se pomocí kapky aplikuje jedna kapka studovaného proteinového roztoku. Zařízení se potom zapne a proudem prochází elektrický proud. Makromolekuly mění jejich náboj v závislosti na pH pufrovacího roztoku. Pokud pH přesáhne IET, pak je pozorován negativní náboj makromolekul a naopak.

Pokud je hodnota pH rovna IET, pak se makromolekuly neutralizují. Po uplynutí určitého časového intervalu přeruší dodávka proudu, jsou z přístroje odebrány proužky papíru a vysušeny, po kterých jsou proteínové skvrny postříkány ninhydrinem pro jejich vývoj. IET je instalován na vyrovnávací roztok pásu papíru, kde proteinové místo zůstává na stejném místě, kde byl aplikován kapka. Pokud je to nutné, lze tuto metodu použít pro jemnou frakcionaci bílkovin.

Použití jiných metod pro určování IET

Když jsou v izoelektrickém stavu molekuly proteinu méně hydratovány, může být proteinový izoelektrický bod stanoven za použití metody s minimální viskozitou. Chcete-li jej použít, potřebujete viskozimetr. Pomocí tohoto přístroje se určí relativní viskozita pufrovacích roztoků. Molekuly proteinu v izoelektrickém stavu jsou složeny tak, že nejmenší viskozita bude v roztoku, ve kterém se jeho pH shoduje s IET.

Na stejném vlastnictví je založena metoda spojená s působením prostředků pro odklon vody. Takovýmto prostředkem může být aceton, ether nebo alkohol. Izolace proteinů z odpovídajících roztoků se potenciálně objevuje rychleji a úplněji, tím více odpovídá reakce prostředí IET. V izoelektrickém bodě jsou roztoky proteinu nestabilní.

Existují tedy různé metody pro určení izoelektrického bodu proteinu. Jeho definice by se měla provádět v závislosti na dostupném vybavení, materiálech, množství bílkovin.

Stabilita bílkovin v IET

V izoelektrickém bodě proteinu dochází k oslabení odpudivých sil mezi částicemi proteinu v makromolekule, což vede k agregaci těchto molekul a proteinových precipitátů. To naznačuje, že v IET je protein nestabilní kvůli ztrátě náboje, což je faktor při stabilizaci vodných proteinových roztoků. Pokud je k proteinu přidána kyselina nebo báze, molekuly se znovu doplňují, protein vede k přechodu do roztoku.

Na závěr

To znamená, že protein izoelektrický bod představuje hodnotu reakčního prostředí (pH), při které se molekuly proteinu rovnosti poznamenali divergentní (negativní a pozitivní) náboje různých stupňů a rovnosti (základní a kyselé) disociace. V tomto okamžiku je protein ztrácí poplatků a stává nestabilní, výsledné sraženiny. proteinová molekula záhyby v době, kdy nese určité náklady, je rozšířen ve tvaru závitu.