Molekulárně-biologické metody výzkumu a jejich využití

Molekulárně-biologický výzkumných metod

Molekulární biologické metody vyšetřování. Co to je?

V 70. a 80. letech byli vědci schopni poprvé popsat lidský genom. Tato událost dala impuls vývoji genetického inženýrství a molekulární biologie. Studium vlastností DNA a RNA vedlo k tomu, že nyní je možné tyto nukleové kyseliny použít k diagnostice onemocnění, ke studiu genů.

Příprava DNA a RNA

Molekulárně-biologický diagnostické metody vyžadují přítomnost výchozího materiálu: častěji se jedná o nukleové kyseliny. Existuje několik způsobů, jak tyto látky izolovat od buněk živých organismů. Každá z nich má své výhody a nevýhody a toto musí být bráno v úvahu při volbě metody izolace nukleových kyselin v čisté formě.

1. Příprava DNA podle Marmuru. Způsob spočívá v tom, že směs látek se zpracovává alkoholem, čímž se vysráží čistá DNA. Nevýhodou této metody je použití agresivních látek: fenolu a chloroformu.

2. Izolace DNA Boomem. Zde používanou základní látkou je guanidin thiokyanát (GuSCN). Podporuje srážení deoxyribonukleové kyseliny na specializovaných substrátech, z nichž lze v budoucnu shromažďovat pomocí speciálního bufferu. Nicméně GuSCN - je inhibitor TCP, a dokonce i malý podíl, který se uloží v DNA může ovlivnit průběh polymerázové řetězové reakce, která je důležitá při práci s nukleovými kyselinami.

3. Srážení nečistot. Metoda se liší od předcházejících tím, že nejsou vysráženy molekuly samotné deoxyribonukleové kyseliny, ale nečistoty. K tomu použijte iontové výměníky. Nevýhodou je, že ne všechny látky se mohou vysrážet.

4. Hromadné vyšetření. Tato metoda se používá v těch případech, kdy není zapotřebí přesné informace o složení molekuly DNA, ale je nutné získat některé statistické údaje. To je způsobeno tím, že struktura nukleové kyseliny může být poškozena ošetřením detergenty, zejména alkalickými látkami.

Klasifikace výzkumných metod

Všechny molekulární biologické metody jsou rozděleny do tří velkých skupin:

1. Zesílení (pomocí různých enzymů). To zahrnuje PCR - polymerázovou řetězovou reakci, která hraje velkou roli v mnoha diagnostických metodách.

2. Neoznačení. Tato skupina metod přímo souvisí s provozem směsí nukleových kyselin. Příkladem jsou 3 typy blotování, in situ hybridizace atd.

3. Metody založené na rozpoznání signálu z molekuly sondy, která se váže na specifickou DNA nebo RNA sondu. Příkladem je hybridizační systém v řešení Hybrid Capture System (hc2).

Enzymy, které lze použít v molekulárně biologických metodách

Mnoho metod molekulární diagnostiky zahrnuje použití široké škály enzymů. Níže jsou nejčastěji používané:

1. Restrictase - "řeže" molekulu DNA do potřebných částí.

2. DNA polymeráza - syntetizuje dvojvláknovou molekulu deoxyribonukleové kyseliny.

3. Reverzní transkriptáza (revertáza) - použitá pro syntézu DNA na matrici RNA.

4. DNA ligáza - zodpovědná za tvorbu fosfodiesterových vazeb mezi nukleotidy.

5. Exonukleáza - odstraňuje nukleotidy z koncových úseků molekuly deoxyribonukleové kyseliny.

PCR je hlavní cestou pro zesílení DNA

Polymerázová řetězová reakce (PCR) se aktivně používá v moderní molekulární biologii. Jedná se o metodu, při které lze obdržet obrovský počet kopií z jediné molekuly DNA (amplifikovat molekuly).

Hlavní funkce PCR jsou:

- diagnostika onemocnění;

- klonování DNA, geny.

Pro provedení polymerázové řetězové reakce vyžaduje následující prvky: počáteční molekula DNA, termostabilní DNA polymerázu (Taq nebo Pfu), deoxyribonukleotid fosfáty (zdroje dusíkatých bází), primerů (primer 2 molekula DNA 1) sám systém vyrovnávací paměti, ve kterém jsou možné všechny reakce.

PCR se skládá ze tří fází: denaturace, žíhání primerů a prodloužení.

1. Denaturace. Při teplotě 94-95 stupňů Celsia pokračuje rozbíjení vodíkových vazeb mezi oběma řetězci DNA a v důsledku toho se dostáváme dvě molekuly s jedním řetězcem.

2. Žíhání primerů. Při teplotě 50 až 60 ° C jsou na koncích jednoretazových molekul nukleových kyselin připevněny primery typem komplementarity.

3. Prodloužení. Při teplotě 72 stupňů dochází k syntéze dceřinných dvouřetězcových molekul deoxyribonukleové kyseliny.

Sekvenování DNA

Molekulární biologické metody často vyžadují znalost sekvence nukleotidů v molekule deoxyribonukleové kyseliny. Určit genetický kód provede se sekvenování. Molekulární diagnostika budoucnosti bude založena na poznatcích získaných při určování pořadí člověka.

Jsou rozlišovány následující typy sekvencí:

• sekvenování od Maxama-Gilberta;
• sekvenování od Sangera;
• pyrosekvencování;
• nanoporézní sekvenování.