Fluorescenční mikroskopie: principy metody

Absorpce a další ozáření světla anorganickými a organickými médii je důsledkem fosforescence nebo fluorescence. Rozdíl mezi jevy spočívá v délce intervalu mezi absorpcí světla a emisí toku. Při fluorescenci se tyto procesy vyskytují téměř současně a s fosforescencí - s určitým zpožděním.

Historické pozadí

V roce 1852 britský vědec Stokes poprvé popsal fluorescenci. Představil nový termín v důsledku experimentů s fluorovodík, který vyzařuje červené světlo pod vlivem ultrafialového záření. Stokes poznamenal zajímavý jev. Zjistil, že vlnová délka s fluorescenčním zářením je vždy větší než vlnová délka excitačního světla.

Pro potvrzení hypotézy v 19. století bylo provedeno mnoho experimentů. Ukázaly, že řada vzorků fluoreskuje pod působením ultrafialového záření. Mezi materiály byly mimo jiné krystaly, pryskyřice, minerály, chlorofyl, léčivé suroviny, anorganické sloučeniny, vitamíny, oleje. Přímá aplikace barviv pro provádění biologických analýz byla zahájena teprve v roce 1930.

Fluorescenční mikroskopie: popis

Některé materiály použité ve studiích první poloviny 20. století měly vysokou specifičnost. Díky indikátorům, které nelze dosáhnout metodami kontrastu, fluorescenční mikroskopie se stala důležitým nástrojem v biomedicínském i biologickém výzkumu. Získané výsledky neměly význam pro vědu o materiálech.

Jaké jsou výhody fluorescenční mikroskopie?? S pomocí nových materiálů bylo možné izolovat vysoce specifické buňky a submikroskopické komponenty. Fluorescenční mikroskop může detekovat jednotlivé molekuly. Různá barviva umožňují identifikaci několika prvků současně. Navzdory omezenému prostorovému rozlišení zařízení pomocí difrakčního limitu, který naopak závisí na specifických vlastnostech vzorku, je také možné detekovat molekuly pod touto úrovní. Různé vzorky po ozařování vykazují autofluorescenci. Tento jev je široce využíván v oboru petrologie, botaniky, průmyslu polovodičů.

Vlastnosti

Studie zvířecích tkání nebo patogenních mikroorganismů je často komplikována buď příliš slabou nebo velmi silnou nespecifickou auto fluorescenci. Významem ve studiích je však to, že se do materiálu vkládají složky excitované při určité vlnové délce a vyzařují světelný tok požadované intenzity. Fluorochromy působí jako barviva schopná se připojit ke strukturám (neviditelné nebo viditelné). Současně jsou vysoce selektivní s ohledem na cíle a kvantový výtěžek.

Fluorescenční mikroskopie se široce používá s příchodem přírodních a syntetických barviv. Měli definitivní profily intenzity emise a excitace a byly zaměřeny na specifické biologické cíle.

Identifikace jednotlivých molekul

Často, za ideálních podmínek, lze zaznamenat záře jednotlivých prvků. K tomu je mimo jiné třeba zajistit dostatečně nízký detektorový šum a optické pozadí. Molekula fluoresceinu před ničením kvůli fotobleachingu může vyzařovat až 300 tisíc fotonů. Při 20% shromáždění a efektivnosti procesu mohou být registrovány ve výši asi 60 tisíc.

Fluorescenční mikroskopie, založené na lavinových fotodiódách nebo na elektronovém násobení, dovolili vědcům sledovat chování jednotlivých molekul během sekund a v některých případech minut.

Potíže

Klíčovým problémem je potlačení šumu z optického pozadí. Vzhledem k tomu, že mnoho materiálů používaných při konstrukci filtrů a čoček vykazuje určitou autofluorescenci, úsilí vědců v počátečních fázích se soustředilo na výrobu složek s nízkou fluorescencí. Následující pokusy však vedly k novým závěrům. Zejména bylo zjištěno, že fluorescenční mikroskopie, založené na plném vnitřním odrazu, umožňuje dosáhnout nízkého pozadí a vysoce intenzivní vzrušující světelný tok.

Mechanismus

Principy fluorescenční mikroskopie, založené na celkové vnitřní reflexe, spočívají v použití rychle se rozkládajících nebo neproliferujících vln. Vzniká na hranici médií různými indexů lomu. V tomto případě světelný paprsek prochází hranolem. Má vysoký index lomu.

Prism je připojen k vodnému roztoku nebo sklu s nízkým parametrem. Je-li tok světla směrován na něj pod úhlem, který je větší než kritický, paprsek se zcela odrazí od rozhraní. Tento jev, na druhé straně, způsobuje vlnu bez šíření. Jinými slovy, generuje se elektromagnetické pole, které proniká do média s menším indexem lomu na vzdálenost menší než 200 nanometrů.

V nepropagující vlně intenzita světla bude dostačující k vzrušení fluoroforů. Nicméně vzhledem k extrémně nízké hloubce bude jeho objem velmi malý. V důsledku toho se objeví pozadí s nízkou úrovní.

Změna

Fluorescenční mikroskopie, založená na celkové vnitřní reflexe, může být realizována pomocí epi-osvětlení. To vyžaduje čočky se zvýšenou číselnou clonou (alespoň 1,4, ale je žádoucí, aby dosáhly 1,45-1,6), stejně jako částečně osvětlené pole zařízení. Ta je dosažena použitím malého místa. Pro větší jednotnost se používá tenký kroužek, kterým je část toku zablokována. K dosažení kritického úhlu, po kterém dochází k celkovému odrazu, je zapotřebí vysoká úroveň lomu ponorného média v čočkách a krycího skla mikroskopu.